ところで君はＵＦＯをみたか。

バイオリアクターの環境浄化への応用

目的
バイオリアクターで環境排水を浄化する。使用する菌は酵母、納豆、乳酸菌など手に入りやすいものを用いてビーズを作成する。CODを測定することで浄化の度合いを確認する。

実験準備試料
アルギン酸ナトリウム最大25g程度
塩化カルシウム最大150g程度
Na2C2O最大20g程度
KMnO4水溶液濃度による
(水溶液が無い場合)推定5g程度(固体)

方法
ビーズの製作
( i )酵母菌, 納豆菌, 乳酸菌, 無のビーズを製作する。
1-1, アルギン酸ナトリウム1gに50mlの精製水を加えて加熱させながら溶解させ、その後は室温程度まで冷却する。
1-2, 菌を50mlの精製水に溶かす。
1-3, アルギン酸ナトリウムの水溶液と菌溶液を混ぜる。
2-1, 塩化カルシウム10gを500mlの精製水に溶かし冷蔵庫で冷却しておく。
3-1, 塩化カルシウム溶液をマグネチックスターラーで撹拌しながら1-3の溶液を滴下する。
3-2, 出来たビーズを冷却しながら３０分間隔で２時間撹拌する。
3-3, 塩化カルシウム水溶液を取り除くため、培養液で２回程度洗う。

( ii )バイオリアクターの製作
調査原液をゆっくり流せるようにコックをつかう。点的みたいな感じのものをつかってもよい。
シリコンチューブか何かでビーズのところまで流してビーズの入っている容器を通過させ、通過した液体を貯める容器にシリコンチューブで流せる構造をつくる。無菌状態にする必要は無い。

( iii )バイオリアクターの使用
調査溶液を４種それぞれのビーズにながす。
流す量は現在まだ未定。
実用化を目的とするならば少量での実験は無意味なので、ビーズの割合を減らすが、流す溶液の量を増やす。安全なビーズの使用期限は２日程度なのでその間に結果の出せる量にする。

( ⅳ )CODの測定
5mM KMnO4標準溶液の標定
1-1, メスシリンダーを用いて精製水100mlを200mlコニカルビーカーにとり、47%硫酸10mlを加える。12.5mM Na2C2O4標準溶液10mLをホールピペットを用いて加え、コニカルビーカーを水浴中で７０〜７５℃で１０分間加熱する。
1-2, 5mM KMnO4標準溶液をビュレットから滴下して滴定し、MnO4-の微紅色が消えずに残る点を終点とする(コニカルビーカーは７０〜７５℃に保つ)。ここで要したKMnO4標準溶液の容量をa(ml)とする。
1-3, 別に、精製水100mlに47%硫酸10mlを加え、Na2C2O4標準溶液を加えずに70~75℃で１０分間加熱したもので空試験をして要した容量をb(ml)とする。
1-4, 5mM KmnO4標準溶液の力価(f)を算定する。F:Na2C2O4標準溶液の力価とする。

2-1, 試料液50mlをホールピペットでとり、200mlコニカルビーカーにとり、精製水を加え約100mlにする。これに47%硫酸10mLを加えて撹拌する。
2-2, 2-1に5mM KMnO4標準溶液10mLをホールピペットで加え、直ちに沸騰水浴中に入れ３０分間加熱する。
2-3, 水浴から出し、ただちに12.5mM KMnO4標準溶液10mlをホールピペットで加えて脱色させる。
2-4, 1-2のように滴定しc(ml)とする。
2-5, 空試験をしてd(ml)とする。
2-6, c,dそれぞれ２回実験し、誤差5%いないなら平均とする。V:試料水の体積(mL), f:KMnO4標準溶液の力価

上記のようにCODを求める。
( vi )CODの評価
CODを指標にして試料原液とブランクビーズ、各菌ビーズを通した溶液のCODを比較し評価する。結果をdatファイルに書き込み、Gnuplotで描画する。


予測：
何も入っていないビーズではアルギン酸ナトリウムの溶解などによりCODが上昇すると考えられる。同じように菌の入っているビーズでも最初はCODの上昇が考えられるが、菌が有機物質を分解していけば試料原液よりもCODは減少するものと考えられ、そうなれば成功である。その度合いを各菌で比較し、実用化できるものなのか考えられる。(納豆菌では実用化されているのでCODは下がる予定である。) その結果によっては実際に水槽か何かの容器に試料原液をためておき、今回の実験よりも大量のビーズを沈めて結果を見る。
今回の実習では１種ごとの値しか出さないが、分解している物質が違う可能性が高いので２種類や２種類などのビーズを複合させてバイオリアクターを作るとCODの低下が分りやすいものが得られるかもしれない。

参考文献：
化学教材としてのバイオリアクター
バイオリアクターを用いた廃棄メロンの利用

大腸菌からのβ-D-フルクトシダーゼの精製

実験過程(概要)
1,培養と試料作成
2,活性の確認
3,塩析
4,活性の確認
5.透析
6,SDS-PAGE

必要な物
1,培養と試料作成
大腸菌
LB培地(実験期間全体で最大4L)
振盪培養器
遠心分離機(10,000*gまでかけられるもの)
遠心チューブ
酢酸緩衝液(pH=5.0)
酢酸
酢酸ナトリウム
ダウンス型ホモジナイザー
恒温水槽

2,塩析
硫酸アンモニウム(特級)

3,活性の確認
グルコース
フルクトース
1% ジニトロサリチル酸
30% 酒石酸カリウムナトリウム
0.4M 水酸化ナトリウム
分光光度計
恒温水槽
ウォーターバス

4,透析
Visking Cellulose Tubing (Viskase社)
マグネチックスターラー

6.SDS-PAGE
装置類
泳動層
泳動板
泳動板用パッキン
コーム
クリップ4個
電源(定電流20~100mA)
ピペットマン
5mlシリンジ
試薬類
30%Acrylamide mixture
0.75M Tris-HCl(pH=6.8)
0.25M Tris-HCl(pH=6.8)
10% Sodium dodecylsulfate(SDS)
N,N,N',N'-Tetramethylethyllendiamide(TEMED)
25% Ammonium Persulfate((APS)
分子量マーカー
2-Mercaptethanol
Sucrose
Bromophenol blue
Tris base
Glycine
10*Running buffer
染色関係
Coomassie brilliant blue R-250
Ethanol
Acetic acid

実験操作
1,培養と試料作成
1-1.培養液(200ml)を遠心管に20mlずつ分け、3,000*gで５分間遠心し、菌体を沈殿させる。
1-2.それぞれ不要な培養液を取り除き、菌体のみにする。
1-3.酢酸緩衝液(pH=5.0)を50ml加えてDounce型ホモジナイザーに入れ１５回ほど破砕する。
1-4.破砕液を40,000rpm(1,000*g)、7分間遠心し、上清を回収する。これを試料Aする。

2,活性の確認
2-1.0.04Mスクロース溶液を３０℃の恒温水槽に入れて予温する。
2-2.200μlの試料Aを0.04Mスクロース溶液200μlと３０℃で反応させる。
2-3.これを正確に1,3,8,15分で400μlのジニトロサリチル酸で反応を停止させる。
2-4.沸騰水中で５分間加熱後、室温で放冷してから4mlの精製水を加える。
2-5.540nmの吸光度を測定する。

3,塩析
3-1.試料A90mlに10mlの0.2M酢酸緩衝液を加える。(試料濃度により変更する)
3-2.マグネチックスターラーの上に氷水の入った容器をおき、その中にビーカーをセットする。
3-3.撹拌しながら、17.9gの粉末硫酸アンモニウムを徐々に添加し、完全に溶解させる。(30%飽和)
3-4.冷蔵庫で一夜放置する。
3-5.20,000*gで約３０分間遠心する。
3-6.3~5を硫酸アンモニウムの濃度を30%,40%,50%,60%で行う。
3-7.目的の酵素が沈殿した濃度より10%低い濃度で硫酸アンモニウムを加えてできた上清に、10%プラスした濃度になるように硫酸アンモニウムを加えたものから上記同様に沈殿を取り出す。

4.活性の確認
沈殿に適当な量の緩衝液を加えた物を作成し、試料とする。これを操作２と同様に進める。

5.透析(SDS-PAGEまで行う場合のみ)
5-1.透析膜を精製水で１０分間煮沸し、保存剤などを取り除く。これを70%EtOH中で保存しておく。
5-2.透析膜の底を縛り、水で孔が空いていないか確認したのち水を捨てる。
5-3.上端より試料を加える。
5-4.上端を2重に縛り、プラスティック棒などに固定する。
5-5.透析チューブをバッファー(試料の100倍程度)の入ったビーカーつるす。
5-6.低温下、スターラーの上で静かに撹拌する。
5-7.2~3時間ごとにバッファーを交換して数時間続ける。
5-8.内液を取り出す。

6.活性の確認
操作２と同様

7.SDS-PAGE
7-1.ゲル板を組み立てる。
7-2.分離ゲルをアクリルアミド濃度10%前後で作成する(結果を見て変える)
7-3.25%APSを50μlを加えて、よく撹拌した後、ゲル板の上から3cmくらいのところまで流し込む。
7-4.1mlピペットマンで静かに精製水を重層する。
7-5.10~20分でゲルが固まるので重層した精製水を捨てる。
7-6.濃縮ゲル溶液を作成する。
7-7.25μlの25%APSを加えて撹拌し、ゲル板にいっぱいまで流し込み、コームを差し込む。
7-8.20~60分でゲルが固まる。
7-9.試料20~50μlと分子量マーカーそれぞれを1.5mlのプラスチックチューブにとり、等量の2*サンプルバッファーを加えて撹拌する。
7-10.沸騰水浴中で３分間加熱する。
7-11.軽く遠心して、水滴を落とす。
7-12.ゲル板からコームを外し、泳動層にセットする。
7-13.5mlシリンジを使い、ウェルに残った未重合のアクリルアミドとゲルの下に溜った泡を、バッファーで吹き飛ばす。
7-14.10~20μlのサンプルをピペットマンでウェルに入れる。
7-15.電源をつなぎ、20mA/ゲル(定電流)で泳動する。
7-16.色素がゲルの先端近くまで移動したら、泳動をやめ泳動バッファーをすててゲル板を取り出す。
7-17.ゲル板をスパーテルを使って剥がす。
7-18.プラステック容器にCBB溶液を50~100mlくらい入れ、そこにゲルを浸し、30~120分振盪する。
7-19.染色液を回収し、脱色液で軽く洗う。
7-20.新しい脱色液中で振盪する。脱色液が青くなったら交換する。脱色液中にキムワイプを入れておく。
7-21.数十分から数時間して、バックグラウンドの色が抜けて、バンドがはっきり見えてきたら、精製水中で５分間以上振盪し、脱色液を置き換える。
7-22.ゲルの水分をのぞき、ラミネートしたものをスキャンする。

参考資料
タンパク質実験ノート上下(第３版)羊土社
基礎生命科学実習II(生命科学部実習書)

再起動 -初代の目覚め-

さて、タカスちゃんが居なくなってしまったということで初代が３代目やっちゃいますよ〜(*´д｀*)
初代は大学２年生になりました!!
いまでは微生物研究部に所属して活動しています。
それで、ここでまた活動を記録していこうかと思っています。

次の活動は夏になると思うのですが、ご期待ください(：D)|￣|＿

炎色反応ロウソクの作成

第二期科学同好会発足しました。

今回は炎色反応の実験として、ロウソクの火に色を付ける実験をしました。



試薬など：塩化銅(Ⅱ)、塩化ストロンチウム、ロウ、たこ糸
使用器具：湯せん鍋、空き缶、ガスバーナー、三脚、100mlビーカー、乳鉢、ドライヤー

-操作-
1.ビーカーに塩化銅(Ⅱ)水溶液、塩化ストロンチウム水溶液を作り、たこ糸を浸しました。
2.たこ糸を取り出しドライヤーで乾燥させました。
3.２個の空き缶に砕いたロウをいれ湯せんして融解させました。
4.乳鉢で塩化銅(Ⅱ)、塩化ストロンチウムをすり潰してそれぞれロウを溶かした空き缶にいれ混ぜました。
5.ロウを型に流し込み、乾燥させておいたたこ糸を真ん中に立てて固まるのを待ちました。
6.ライターで完成したロウソクに点火。

-結果-
どちらも糸が上手く燃えてくれず、失敗でした。
ちゃんと乾燥できていなかったようです。少しだけしか炎色反応を見ることが出来ませんでした。
ストロンチウムの方は燃やし始めの時に花火のような火花がでました。
今年度初めての実験で新入会員は初めての実験だったので成功させたかったのですが残念でした。
そのうちまた、挑戦できればと思います。




追記

6月中はずっとロウソクを作っていましたが結局成功しませんでした。
最初の実験からの改善点を挙げてみます。

○合成繊維を使用した糸を使ってしまっていたので糸を綿糸に変更。
○各溶液に浸した糸は水を吸う前になるべく早くロウに浸す。
○飽和水溶液を使う。

まだこれからの改善点も幾つか見当たります。
炎色反応ロウソクの実験は夏休みに持ち越します。

↓動画を撮ったのでアップロードしてみました。

炎色反応ロウソク
Uploaded by Chlorophyll-a. - Videos of the latest science discoveries and tech.

by K.takachu

遺伝子組み換え作物農場の見学会

今日は同好会のメンバーを含んだ珍しいメンバーで日本モンサント株式会社さんの試験農場に行ってきました。
ここでは大豆やトウモロコシなどの遺伝子組み換え作物を育てていました。

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モンサントさんは除草剤（ランドアップ）を使うことを前提とした作物をつくるために遺伝子組み換えをしてランドアップ耐性をもった遺伝子組み換え作物を作っています。


ここで農薬であるラウンドアップについて説明します。
世界130カ国で20年以上にわたって様々な場面で利用されています。
雑草の葉に散布する茎葉処理型で、ほとんどの雑草を防除できます。
また、土壌中で水や炭酸ガスに分解されます。
なので人や自然に優しいといわれています。
どのように植物を枯らすのかというとラウンドアップ（クルホサート）はシキミ酸合成経路のEPSPS酵素をブロックするためアミノ酸（チロシン・フェニルアラニン・トリプトファン）の合成がされなくなるためタンパク質が合成されなくなります。
そのため耐性を持つ作物にはグルホサート耐性EPSPS酵素を作るRoundup Ready遺伝子が組み込んであります。
それにより雑草のみが枯れることになります。



↑これが普通にGM大豆の無除草区です。
普通に大豆が雑草と一緒に育っていました。

↑これがそのラウンドアップ散布区です。
雑草だけが枯れてGM大豆は元気でした。



これが分かりやすい写真になります。
すべて大豆ですが一番右はGM大豆です。
これにはラウンドアップが散布してあるのですが遺伝子組み換え大豆は耐性によって全く影響を受けていません。

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害虫抵抗性作物も育てれられていました。
これも上記の農薬耐性作物のようにタンパク質を作る遺伝子を組み込むのですが、
それに使う遺伝子は枯草菌であるBacillus thuringiensis由来の遺伝子を使っています。
この遺伝子の作る害虫抵抗性タンパク質は特定の害虫に効果を発揮します。
抵抗性を持つことによって殺虫剤の使用量を減らしたりコストの削減になるので環境に優しい農業をできます。
また、害虫によって食べられた箇所にカビなどが生えてしまう場合がありますがそれを防ぐことにもなります。



普通のトウモロコシはこうなっています。
害虫（アワノメイガ）によって枯れている部分があります。

これがアワノメイガによって被害を受けている場所の写真です。
茎の中に幼虫が入り食べられてしまい枯れています。


これが中に入っていた幼虫です。

ここではGMトウモロコシを育てています。
害虫抵抗性があるため全く被害を受けていませんでした。

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以上、見学レポートでした。

ミクリロソリウム＃2

アクアリム屋で安かったから買ったミクロソリウムは根がなくて葉だけでした。
それで９０ｃｍ水槽に挿してみたところ子株がいっぱい出てきたので
取り出して空いていた３０ｃｍ水槽に入れました。
もっと大きくなるまで流遊させておく予定です。
現在は葉が２ｃｍくらいなのでまだ時間がかかりそうです。

ミクリロソリウム＃１

ミクロソリウム typeⅠ


ミクロソリウム　typeⅡ


ミクロソリウム typeⅢ

買ってみたら量が多かったので入らない分は学校の水槽の流木に植えつけました。


自宅の水槽は最初からキャパ足らなくなるのはマズイので1/3くらいにしておきました。

水草採集＃２

今回はおじいちゃんと一緒に湿地の水草採取に行きました。

採集場所は休耕田でした。
使わなくなって１年目くらいでしたので大型の植物はなく小さい種類ばかりでした。
ここにはウリカワなどが生えていました。

持ち帰った水草はリセットした水槽で育てることにしました。
ウリカワとよく分からない水草が一種類です。

採取した土の中に変な生物が紛れ込んでいました。

レットビーシュリンプ水槽

レットビーシュリンプの水槽を立ち上げました。
前からやってみたかったので良かったです。

水槽自体を1ヶ月くらい維持したあと5匹のレットビーシュリンプと1匹のビーシュリンプを飼ってきて入れました。
水あわせも一滴ずつゆっくりやったのですが一ヶ月くらいたった今、半分の3匹になってしまいました。

この水槽には採取してきて育てていた良く分からない水草を入れました。
名前が分かる方はコメントよろしくお願いします。
モスが荒れていたのでタイルに巻き付ける事にしました。
左が先生が作ったもので右が僕です。
惨敗でした。

マングローブ＃１３

寒さが原因で出来たと思われる被害が出てしまいました。
養分が多すぎたときとは違い透き通っている感じがします。

そこで一時的にではありますが寒さを防ぐようにしてみました。
テストが終わったらちゃんとしたものを作ろうと思います。

マングローブ育成＃１２

ついに頂芽を取り除きました。
側芽も出来てきたので背を低く維持するために取り除く必要があったのです。
マングローブでこれをやった人は知らないので出来るかどうかわかりません。

これが出来てきた側芽です。
これが大きくなってきたら面白くなります。
根も大きくなってきました。
水栽培タイプに変更しました。
サンゴの中では管理が行いにくいのでこの方が栽培しやすくなりました。

マングローブ育成＃１１

太陽の方向に向かって伸びていくのでだんだんと窓側へ曲がってきてました。
それでは良くないので照明を反対側に吊り下げてまっすぐにしてみようと思って、やってみたら3時間くらいで真っ直ぐになりました。

新しい芽も大きくなってきて、また新しい芽が出てきました。
これからの季節はどんどん日照時間が減ってくるので成長は遅くなりそうです。
栄養も減らしていくことにしました。
日照時間を補充するために蛍光灯を使うのも出来ますが、急いでいるわけではないので悪天候のとき以外は控えておこうと思います。

アクアリウム＃４

今日、ベタ♀が卵を自分で食べ始めました。
最悪な事態が発生しました。
オスは巣を作るのをやめたしもう終わってしまったようです。

今回は失敗ってことで終わりにします。
暇になったら情報収集してチャレンジしてみたいと思います。
それまではベタの瓶詰めでも眺めます。

アクアリウム＃３

最初から一緒にすると片方が死んでしまうこともあるので気をつけていたので
今のところメスがオスの攻撃を受けないように仕切っていましたが、大丈夫なようなので今日から一緒に飼うことにしました。

全然おとなしくケガとかしなさそうなのでそのままにしてみました。
ここで仲良くしてくれて良かったです。

そしたらオスが泡を出し始めました。
泡巣を作っているんだろうと思ったので底面ろ過のためのエアレーションを弱くしてウキクサで波を打ち消して泡が壊れないようにしてみました。

これで泡が壊れなくなったと思います。
ウキクサは思ったより消波作用があるようです。

泡を作るのを助けるため照明をつけてみました。
これでゆっくり泡をつくれると思います。
それとマングローブの光合成を多くすることにもなると思います。
電球ソケットを探し出したら白熱灯の付いたのが出てきたので蛍光灯に変えました。
それを使っていなかった三脚から吊るして使ってみました。

マングローブ育成＃１０＋アクアリウム＃２

マングローブ水槽にショーベタを入れてみました。
種類は忘れました。
ヒレのボロボロな感じが気に入っています。
名前でも付けようかと思っています。

他にも水草を買ってきて入れてみました。
一束買ったのですが植えてみると半面が占領されてしまいました。

気温も低くなってきたのでヒーターも入れました。
これで大丈夫だと思うのですがマングローブの葉の方は温まらないので

ツガイで飼ってきたのですが仕切りをしなければならないようなので使っていなかった水槽の上蓋を使ってみました。
これで慣れるのを待つようです。
色々なサイトを見て勉強中です。